No futuro, com o desenvolvimento destas técnicas, será possível usar IPSCs em terapia celular, ou seja, na geração de células apropriadas para o tratamento de enfermidades de difícil tratamento. Por exemplo, o tratamento das sequelas do infarto do miocárdio.
Imagine que você trabalha em um laboratório de pesquisa científica que estuda o uso das IPSCs na recuperação dos danos causados ao coração por infarto do miocárdio. Para verificar a eficácia das metodologias que você elaborou, camundongos são utilizados como cobaias para os experimentos. No seu projeto de pesquisa, você pretende gerar IPSCs a partir de fibroblastos isolados de derme e diferenciá-los em cardiomiócitos que seriam implantados, então, em camundongos com corações infartados.
Antes de transferir os cardiomiócitos, você precisa averiguar se houve diferenciação e se a solução com as células é altamente pura, ou seja, apenas células cardíacas devem estar presentes.
Soluções para a tarefa
Resposta:
a) O primeiro passo é isolar os fibroblastos da derme de camundongos. Para isso, um fragmento de tecido é removido e com a utilização de enzimas proteolíticas (tripsina, por exemplo) e um sequestrador de cálcio (EDTA) as células são individualizadas. Como as células precisam ser mantidas vivas fora do organismo, procede-se a sua cultura em frascos com meio de cultura apropriado.
b) Os fibroblastos são facilmente separados do restante das células da derme, pois são células aderentes e sobrevivem por mais tempo em cultura. Assim, conforme a cultura for sofrendo passagens, a população de células se tornará mais homogênea. Pela indução da produção de moléculas típicas de CTEs, especificamente as proteínas produto dos genes NANOG, OCT-4, SOX-2 e CMYC, os fibroblastos são transformados em IPSCs.
Essas células, por sua vez, também precisam ser mantidas em cultura, submersas em meio apropriado e em frascos de cultura específicos para o cultivo de CTEs. Esses frascos apresentam uma camada de substâncias no seu fundo que auxilia, juntamente com o meio de cultura, a sobrevivência das IPSCs. Para diferenciá-las em cardiomiócitos, as IPSCs são acondicionadas, por certo tempo, em meios de cultura cuja constituição induz tal diferenciação. Após este período, é necessário verificar se houve diferenciação. Isto pode ser feito com a utilização de anticorpos marcados contra a proteína miosina (característica de células cardíacas). Se os anticorpos forem marcados com uma molécula fluorescente, será possível verificar a presença de miosina em microscópio de fluorescência.
c) Depois de verificada a ocorrência de diferenciação, é necessário separar os cardiomiócitos das IPSCs que não diferenciaram. Para isto, podem ser utilizados novamente os anticorpos marcados que reconhecem a miosina. Os anticorpos são adicionados à mistura de células e depois ela é passada por um equipamento do tipo cell sorter. Por esse procedimento, as células marcadas com anticorpos fluorescentes (os cardiomiócitos) serão separadas das IPSCs que não diferenciaram.
Explicação: