A técnica de western blotting também pode ser denominada proteína immunoblot e consiste na detecção de proteínas especificas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3) transferências proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína especifica a ser analisada; e (5) revelação dessa membrana para análise dos dados. Considerando esse contexto, analise as seguintes afirmativas:
I. Para a extração e quantificação de proteínas o ensaio de Bradford e? o mais utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. Para quantificar a concentração de proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações conhecidas de uma proteína (comumente se utiliza soro albumina bovina, BSA) versus absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve).
II. A etapa de fracionamento de proteínas a técnica mais utilizada e? a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de SDS-poliacrilamida, que será? uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão migrar. O gel e? preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para retardar a migração da sua proteína de interesse.
III. Na etapa de transferência para membrana e? necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada, mas antes, e? preciso que essas proteínas estejam em um suporte sólido, como membranas de nitrocelulose, PVDF ou de catiônicas de nylon. Essa transferência das proteínas do gel para a membrana inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferência eletrofore?tica que e? muito mais rápida e eficiente.
IV. Para detectar a proteína especifica e? utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epi?topo da proteína, formando um complexo anticorpo-anti?geno. Esse anticorpo e? denominado anticorpo primário, pode ser policlonal (reconhece mais de um epi?topo) ou monoclonal (reconhece apenas um epi?topo da proteína de interesse) e e? produzido geralmente em camundongo ou em coelho.
Considerando as informac?o?es apresentadas, e? correto o que se afirma em:
Alternativas:
a)
I, apenas.
b)
I e II, apenas.
c)
II, III e IV, apenas.
d)
I, II e IV, apenas.
e)
I, II, III e IV.
Soluções para a tarefa
Resposta:
Apenas II e IV são incorretas.
A alternativa II está errada porque correto seria dizer que a mudança de cor se dá do vermelho para o azul
A alternativa IV está errada porque é utilizado um anticorpo secundário.
A base da tecnologia de Western blotting é separar proteínas por peso molecular por meio de eletroforese, depois transferir para uma membrana e usar anticorpos específicos para detectar a proteína alvo.
Explicação:
A base da tecnologia de Western blotting é separar proteínas por peso molecular por meio de eletroforese, depois transferir para uma membrana e usar anticorpos específicos para detectar a proteína alvo.
As afirmativas corretas sobre a detecção de proteínas, são
E) I, II, III e IV.
O ensaio de Bradford é o método mais utilizado para extrair proteínas, já que ele tem muitas vantagens, como ser rápido, não precisar de aquecimento e ser capaz de extrair proteínas mesmo em baixas concentrações nas amostras.
Quanto mais especifica for a proteína que precisa ser extraída, mais especifica precisa ser a técnica, por exemplo, as técnicas que utilizam anticorpos para extrair as proteínas.
o uso de anticorpos é relativamente simples, já que eles são específicos e conseguem captar a proteína que se busca extrair, mas tende a ser caro.
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